組織工学により作製された構造物を製造するための方法

专利摘要:
心臓弁などの組織工学により作製された構造物を生産するための方法は、バイオリアクターチャンバ中に細胞播種足場を供給し、バイオリアクターチャンバを細胞播種足場によって第１の区画と第２の区画とに分けるステップと、細胞播種足場をバイオリアクターチャンバ内部の培養液の流れにさらすことによって、細胞播種足場を組織構造へ、そしてさらに組織構造物へと発達させるステップと、培養液の流れによって、発達中の組織構造に対して動的な圧力差をかけることによって、組織構造上に動的歪みを誘導するステップと、を含む。
公开号:JP2011511657A
申请号:JP2010544902
申请日:2009-02-02
公开日:2011-04-14
发明作者:コートスミット、ジェローン；ドリエッセン、ニルス、ヨゼフ、バート；バーイジェンス、フランシスカス、ペトルス、トーマス；ルッテン、マルセル、コルネリウス、マリア
申请人:スティッチング ヴォール デ テクニッシェ ヴェッテンシャッペン；テクニーシェ・ユニバーシタイト・アイントホーベン；
IPC主号:A61L27-00

专利说明:

[0001] 本発明は、組織工学により作製された心臓弁などの構造物を製造するための方法に関する。]
背景技術

[0002] 欧州特許出願公開第１６９３０２５（Ａ１）号明細書には、バイオリアクターおよび組織工学により作製された心臓弁を製造するための方法が開示されている。そこでは、心臓弁の弁尖（ｌｅａｆｌｅｔｓ）の表面に動的な圧力差（ｄｙｎａｍｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）をかけることによって、発達中の心臓弁が動的歪みにさらされる。]
[0003] この既知の方法の欠点は、構造物を犠牲にし、続いて引張試験または圧子押し込み試験を行うことによってのみ、心臓弁組織の力学的挙動を評価することができることである。その結果、移植された心臓弁の特性がテスト用に犠牲になった心臓弁の特性と同じかどうかまだ確実には分からない状態で、たとえば移植用に第２の心臓弁を得るために、多数の心臓弁を同一の条件下で培養する必要がある。多数の心臓弁を培養することによって、この方法がよりコストの高いものとなり、似たような条件下で培養された第２の心臓弁が、テストされた心臓弁と同じ力学的特性を有することの保証もできなくなる。]
[0004] この方法および最も最近のバイオリアクターシステムの第２の欠点は、負荷をかける際に制御ができないことである。どう歪みが生じるかが分からないにもかかわらず、発達中の心臓弁に対して圧力がかけられる。組織の力学的特性を変化させることによって、培養中に歪みが変化してしまう可能性がある。しかし、組織の再形成に対してかけられた歪みを変化させることによる影響は、まだ知られていない。]
[0005] 心臓弁を発達させるための第２の方法は、米国特許第５８９９９３７号により知られている。この方法は、カラードップラーフローマッピング（ｃｏｌｏｒ Ｄｏｐｐｌｅｒ ｆｌｏｗ ｍａｐｐｉｎｇ）、スペクトルドップラー解析、またはレーザードップラー測風学（ａｎｅｍｏｍｅｔｒｙ）を利用することによって、大動脈弁の近くの流動場を明らかにする。それらの測定結果によって流速を推定することができる。流速の推定値からせん断応力を計算することができる。この方法はさらに、ビデオ撮影を利用することによって、弁の開閉特性を測定する。この方法では、大動脈圧と、弁を横切る血圧の低下が記録されて、各弁が同じような流動条件におかれていることを確かめるために使用される。この方法の欠点は、力学的特性に関する限り、弁の性能は、破壊的および／または侵襲的な方法によってしか判断できないことである。]
先行技術

[0006] 欧州特許出願公開第１６９３０２５（Ａ１）号明細書
米国特許第５８９９９３７号]
[0007] 本発明は、上述の問題を解決することを目的とする。また、本発明は、
バイオリアクターチャンバ中に細胞を播種した足場（細胞播種足場：ｃｅｌｌ−ｓｅｅｄｅｄ ｓｃａｆｆｏｌｄ）を供給することによって、バイオリアクターチャンバを細胞播種足場によって第１の区画と第２の区画とに分離するステップと、
細胞播種足場をバイオリアクターチャンバ内部の培養液の流れにさらすことによって、細胞播種足場を組織構造へ、そしてさらに組織構造物へと発達させるステップと、
培養液の流れによって、発達中の組織構造に対して動的な圧力差をかけることによって、組織構造上に動的歪み（ｄｙｎａｍｉｃ ｓｔｒａｉｎ）を誘導するステップと、
動的な圧力差を測定するステップと、
発達中の組織構造の体積の変化を測定するステップと、
測定された体積の変化および組織構造がバイオリアクター内部にあるときに組織構造上にかけられた圧力差から、組織構造の少なくとも１つの力学的特性の大きさを決定するステップと、
決定された少なくとも１つの力学的特性の大きさが所定の閾値を越えているどうかを判定するステップと、
決定された少なくとも１つの力学的特性の大きさが所定の閾値を越えていない場合には、組織構造を動的な圧力差にさらし続けることによって、動的歪みを誘導するステップと、
決定された少なくとも１つの力学的特性の大きさが所定の閾値を越えている場合には、組織構造を動的歪みを誘導するための動的な圧力差にさらし続けることを停止するステップと、を含む方法を提供する。]
[0008] これらのステップによって、培養された心臓弁の弁尖のような組織構造物（または組織構造物に発達する組織構造）の力学的特性を、リアルタイムの非侵襲的で非破壊的な方法によって、正確に特性評価やテストを行うことが可能になる。さらに、その方法は組織の再形成を長時間かけてモニタするために使用することもできる。これらのステップによって、心臓弁の代替物のような、組織工学により作製された構造物の組織工学用の調整プロトコールを使用することがさらに可能になる。この場合、閾値は、弁の少なくとも１つの力学的特性を示すために使用される所定の値である。この閾値をたとえばインプラントとして使用される弁の性質と関係づけることができるため有利である。少なくとも１つの力学的特性について、測定された値の大きさが閾値を上回ったら、組織構造が組織工学により作製された構造物になったとみなすことができる。体積の変化は、単一の負荷サイクルにおいて、バイオリアクターチャンバの第２の区画から出て後に第２の区画に再び入ってくる培養液の量として定義されることに注意する。]
[0009] 本発明の好適な実施態様によると、本方法は、測定された体積の変化から局所的な組織の歪み（ｓｔｒａｉｎｓ）を決定するステップを含む。局所的な組織の歪みを決定できることによって、組織構造が発達する際にかけられた機械的な負荷による影響を、系統的に研究することが可能となる。]
[0010] さらに好適な実施態様によると、本方法は、数値モデルを適用することによって、組織構造および／または局所的な組織の歪みの少なくとも１つの力学的特性の大きさ（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）を決定するステップを含む。数値モデルを利用することによって、発達中の組織構造の力学的特性を、リアルタイムに非侵襲的で非破壊的な方法によって決定することが可能となる。]
[0011] 本発明の別の好適な実施態様は、上述の（ｐｒｅｖｉｏｕｓ）方法に従った方法であり、測定された局所的な組織の歪みに応じて、および／または測定された組織構造の少なくとも１つの力学的特性の大きさに応じて、動的な圧力差を変化させるステップをさらに含む。このようにして、組織構造の発達を最適化することができる。]
[0012] 本発明の別の好適な実施態様は、好ましくは１０ｋＰａ〜２０ｋＰａ、より好ましくは１３ｋＰａ〜１７ｋＰａの最大値まで、動的圧力を徐々に大きくするステップをさらに含む、上述の方法に従った方法である。これによって、発達する構造物の組織が周期的に歪む結果、細胞増殖および機能的組織の形成が助長される。]
[0013] しかし、別の好適な実施態様は、０．１Ｈｚ〜１０Ｈｚ、より好ましくは０．５Ｈｚ〜３Ｈｚの周波数を有する動的な圧力差をかけるステップによって特徴づけられる。この動的な圧力差によって、心拍の連続（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の生理値と似た周波数範囲で、弁に対して局所的な組織の歪みが引き起こされる。]
[0014] 組織構造が十分に発達することができるようにするためには、動的な圧力差が少なくとも６日間かけられるのが好ましく、１６〜２８日間かけられるのがより好ましい。]
[0015] 細胞播種足場を２ｍｌ／分〜６ｍｌ／分の速度で培養液の連続する流れにさらすことによって、細胞播種足場を組織構造へと発達させるのが好ましい。このステップによって、播種された細胞が発達し、足場に付着することができる。また、このステップによって、細胞に新鮮な栄養を供給することができる。]
[0016] バイオリアクターチャンバ中の培養液の連続する流れは、動的な圧力差が発達中の組織構造に対してかけられる前に、少なくとも３日間かけられることが好ましい。]
[0017] 他にも方法はあるが、本発明は心臓弁を製造するのに非常に適している。したがって、好適な実施態様によると、組織工学により作製された構造物は心臓弁である。]
[0018] 心臓弁の組織に発達する組織構造に対する動的圧力は、心臓弁（に発達する組織構造）が閉じた状態でかけられるのが好ましい。このようにして、動的な圧力差および体積の変化の正確な測定を行うことができる。本発明による方法を使用すれば、弁は開くことなく閉じた状態のままである。心臓弁の組織工学では、多くのバイオリアクターが開発されてきたが、ほぼすべてのシステムが生理的流れを模倣しようとしている。これらのシステムは、心臓収縮期と心臓拡張期の両方を模倣して、広範な生理的範囲で機械的な負荷をかけるか、または心臓周期の収縮期もしくは拡張期のシミュレーションに特徴を有するか、のいずれかである。しかし、拡張期もしくは収縮期は心臓周期の耐負荷期を意味する。そこでは、心臓弁の組織に対して大部分の歪みがかけられる。発達中の構造物に対する組織の周期的な歪みの好ましい効果は実証されてきた。組織の周期的な歪みは、細胞増殖および機能的組織の形成を助長する。さらに、静的な制御に比べて、引張強度が極度に増大し、組織が硬化することが観察される。]
[0019] ドナーであるヒトまたは動物の組織構造物を力学的特性に関してテストしなければならない場合にも、本発明によって利益が得られる可能性がある。この点で、本発明は心臓弁などの組織構造物をテストする方法とも関係する。本発明は、
テストされる組織構造物、好ましくは閉じた状態の心臓弁をバイオリアクターチャンバ中に供給し、バイオリアクターチャンバを組織構造物によって第１の区画と第２の区画とに分けるステップと、
組織構造に対して動的な圧力差をかけることによって組織構造上に動的歪みを誘導するステップと、
動的な圧力差を測定するステップと、
組織構造物の体積の変化を測定するステップと、
測定された体積の変化および組織構造上にかけられた圧力差から、組織構造物の少なくとも１つの力学的特性の大きさを決定するステップと、を含む。]
[0020] 組織構造物は、こうして一般にリアルタイムに非侵襲的で非破壊的な方法によってテストされてもよい。これによって組織構造物は弁へと成長し発達することが可能となる。性能を評価するために、これらの弁をバイオリアクターの内外で機械的なテストにかけることなく、弁をインプラントとして直ちに使用することができる。これによって、移植の前に弁を汚染してしまうリスクをかなり低減することができる。汚染してしまうと、弁をインプラントとして使用することができなくなる。さらに、弁の力学的特性を測定することで弁が犠牲になってしまうような方法は、もはや使用する必要がない。]
[0021] 本方法は、動的な圧力差をかけるために組織構造物をバイオリアクターチャンバ内部の培地の流れに対してさらすステップ、および／または組織構造物がバイオリアクターチャンバの内部にある間に、組織構造物の少なくとも１つの力学的特性の大きさを決定するステップを含むのが好ましい。]
[0022] 本発明を以下の図を参照してより詳細に説明する。]
図面の簡単な説明

[0023] ２つの調整プロトコールを示す。
かけられた圧力差、引き起こされた歪み、および力学的特性の間の数値的に得られた関係である。
図１ａに示した調整プロトコールに従って培養された、２つの培養された心臓弁の弁尖に対してかけられた圧力差と、引き起こされた体積の変化との間の、測定された関係およびフィッティングを行った（予測された）関係を示す。
図１ｂに示した調整プロトコールに従って培養された、４つの培養された心臓弁の弁尖に対してかけられた圧力差と、引き起こされた体積の変化との間の、測定された関係およびフィッティングを行った（予測された）関係を示す。
２つの既定の機械的な調整プロトコールを示す。これらは組織工学により作製された心臓弁に対してかけられる既定の体積の変化（ｍｌ）を示す。下側の歪みプロファイルはプロトコール３（実験３用）を示し、上側のプロファイルはプロトコール４（実験４用）を示す。
培養時間（日）の関数として示された、組織工学により作製された心臓弁Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの測定された体積の変化値（ｍｌ）を示す（実験３）。
培養時間（日）の関数として示された、組織工学により作製された心臓弁Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの測定された体積の変化値（ｍｌ）を示す（実験４）。] 図１ａ 図１ｂ
[0024] （詳細な説明）
図２は、心臓弁の弁尖に対してかけられた圧力差［ｋＰａ］、引き起こされた歪み［ｍｌ］、および剛性率×心臓弁の厚さで定義される力学的特性［ｋＰａ・ｍ］の間の数値的に得られた関係である。] 図２
[0025] 心臓弁の弁尖にかけられた圧力および引き起こされた体積の変化（ｉｎｄｕｃｅｄ ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の組み合わせを、心臓弁の弁尖の力学的特性に関連づけるために、心臓弁の準静的な数値モデルを採用する。このモデルでは、弁尖は圧縮できないと仮定される。したがって、全コーシー応力（σ）は静水圧（ｐ）と余分な応力（τ）とに分かれる。
σ＝−ｐΙ＋τ （１）]
[0026] 非線形の力学的挙動をモデル化するために、以下の非線形ネオフック（Ｎｅｏ−Ｈｏｏｋｅａｎ）モデルが使用される。
τ＝Ｇ（Β）（Β−Ι） （２）]
[0027] 式中、剛性率Ｇは以下の式から計算される。
Ｇ（Β）＝Ｇ０（Ιｌ（Β）／３）ｎ （３）]
[0028] 式中、Ｇ０とｎは材料パラメータである。Ｉｌ（Β）（＝ｔｒ（Β））は、左コーシー−グリーン歪みテンソルの第１の不変量をあらわし、Β＝Ｆ・Ｆτから計算される。ここでＦは歪み勾配テンソルである。パラメータｎは、構成方程式の非線形性の程度を表す。つまり、「ｎ＞０」は、負荷が強くなるのに伴って材料が硬くなることを示す。一方、「ｎ＜０」は、柔らかくなることを示す。]
[0029] 解かなければいけない平衡方程式は、運動量の保存と、非圧縮性固体に対する質量である。]
[0030] ]
[0031] Ｊ−ｌ＝０ （５）]
[0032] 式中、Ｊ（＝ｄｅｔ（Ｆ））は、歪まずストレスのかかっていない形状と歪んだ形状との体積変化率をあらわす。]
[0033] 閉じた形状の弁尖の有限要素メッシュ（ｆｉｎｉｔｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｍｅｓｈ）は対称であるため、弁尖の半分のみから構成されている。対称性の端部（ｓｙｍｍｅｔｒｙ ｅｄｇｅ）において、正常方向への節の変移（ｎｏｄａｌ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）は抑制される。固定された端部の底（心室）側において、節の変移はすべての方向に抑制される。固定されていない端部において、接触面は隣接する弁尖の接合を形成するように規定される。ここでは弁尖の半径は１２ｍｍに設定される。弁尖の上面に圧力がかけられることによって、かけられた心臓を拡張する弁内外の負荷が形成される。その後、体積の変化が計算される。]
[0034] かけられた圧力、引き起こされた体積の変化、および装着された心臓弁の力学的特性の三次元的関係を得るために、シミュレーションを行った。力学的特性は、心臓弁の厚さ（ｔ）と剛性率（Ｇ）との積として定義した。また、力学的特性は、モデルに対する入力データとして、異なる組み合わせで使用した。これらの入力パラメータの範囲は、先行研究の実験データを含めるために選択した。剛性率（Ｇ）は０．１〜２．０ＭＰａの範囲で変化させ、厚さ（ｔ）は０．３５〜１．０ｍｍの範囲で変化させた。心臓弁の非線形材料の挙動の次数（ｎ）は、ｎ＝１０で一定に保たれた。あらゆる組み合わせの厚さおよび剛性率に対し、０〜１５ｋＰａの範囲の圧力差を弁に対してかけることによって、引き起こされた歪みを計算した。そうしてそれらの量の三次元的関係が得られた。しかし、すべての圧力−歪みのセットが力学的特性に対して１つの固有の値となるような三次元プロットを得るために、シミュレーションの結果を用いて表面のフィッティングを行った。]
[0035] 実施例１（実験１および２）
当業者に周知の方法にしたがって、細胞が培養され足場上に播種された。バイオリアクターチャンバ中に供給された細胞が播種された足場（細胞播種足場）を、培養液の連続的な流れ（２ｍｌ／分〜６ｍｌ／分の速度）にさらすことによって、播種された足場を組織へと発達させた。細胞播種足場は、バイオリアクターチャンバ中で培養液の連続的な流れに３日間以上さらすのが好ましい。]
[0036] 次に、０．１〜１０Ｈｚの周波数の動的な圧力差を、心臓弁の弁尖に対して６日間以上（好ましくは１６〜２１日間）かけた。２つの調整プロトコールが図１に示されている。図１では、組織工学により作製された心臓弁１−１および１−２（図１ａ）ならびに心臓弁２−１〜２−４（図１ｂ）に対してかけられた負荷（ａｐｐｌｉｅｄ ｌｏａｄ）が、培養時間の関数として示されている。第１の実験（実験１）では、９日間にわたり負荷がかけられた。負荷は３日ごとに大きくした。９日間の処理後、負荷は一定に保たれた。３週間の総培養時間経過後、心臓弁（弁１−１および弁１−２）が使用された（図１ａ）。第２の実験（実験２）では、実験が終了するまで、かけられる応力を３日ごとに段階的に増加させた。心臓弁の培養は３週間後（弁２−２および弁２−４）、および４週間後（弁２−１および弁２−３）に終了させた（図１ｂ）。] 図１ 図１ａ 図１ｂ
[0037] 第１の実験で培養された心臓弁の弁尖に対してかけられた圧力差［ｋＰａ］と引き起こされた体積の変化［ｍｌ］との間の測定された関係、およびフィッティングを行った（予測した）関係が、図３ａおよび図３ｂに示されている。弁１−１（図３ａ）および弁１−２（図３ｂ）では３週間の培養後、使用する直前にデータが得られた。] 図３ａ 図３ｂ
[0038] 第２の実験で培養された心臓弁の弁尖に対してかけられた圧力差［ｋＰａ］と引き起こされた体積の変化［ｍｌ］との間の測定された関係、およびフィッティングを行った（予測した）関係が、図４に示されている。弁２−２（図４ｂ）および弁２−４（図４ｄ）では３週間の培養後、弁２−１（図４ａ）および弁２−３（図４ｃ）では４週間の培養後、使用する直前にデータが得られた。] 図４ 図４ａ 図４ｂ 図４ｃ 図４ｄ
[0039] 表１は、心臓弁の相対漏出量（漏れ（％））および実際の心臓弁の測定値と本発明による予測値との間の相関係数を示す。表１から分かるように、測定値と予測値との間には強い相関関係が存在する。心臓弁２−２の場合だけ相関係数が少しだけ低い。これは心臓弁２−２の相対漏出量が高いためである。負荷をかける際に、流量測定を行うことによって、体積の変化および心臓弁の弁尖の漏れを評価した。体積の変化は、単一の負荷サイクルにおいて、第２の区画側においてバイオリアクターから出て後に再び入ってくる培養液の量として定義された。第２の区画からバイオリアクターを出る正味の流れ（ｎｅｔ ｆｌｏｗ）は、弁から漏れる液体の量として定義された。]
[0040] これが示すのは、組織工学により作製された人工器官を製造するための本発明にしたがった方法によって、組織工学により作製された心臓弁の弁尖の力学的特性を、培養中および培養後にリアルタイムで非侵襲的かつ非破壊的に、総合的に評価することが可能になるということである。したがって、本方法は、リアルタイムで非侵襲的かつ非破壊的な品質チェックとして機能することができる。]
[0041] ]
[0042] 実施例２（実験３および４）
心臓弁を播種した後、構造物がバイオリアクターシステム中に配置され、低速（４ｍｌ／分）で循環する培地に１２日間さらされる。それにより、播種後の初期の組織発達が可能となる。その後、（１Ｈｚにおける）動的な圧力差が心臓弁の弁尖に対して１６日間かけられる。総培養時間には、（低速で）培地を循環させることも、人工心臓弁に対して動的な負荷をかけることも含まれる。]
[0043] 両方の実験において、２つの異なる所定の力学的な調整プロトコールが、組織工学により作製された弁に対して適用された（図５）。負荷をかけることによって、歪みを制御した（ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）。動的な負荷の大きさは、組織培養１３日目から２１日目まで弁尖の歪みの程度の増大が誘導されるように制御された。２１日目から培養終了まで、体積の変化が０．１ｍｌ（プロトコール１）および０．１５ｍｌ（プロトコール２）の値で一定に保たれた。いずれの実験でも、心臓弁ＡおよびＢに対してはプロトコール１が適用され、心臓弁ＣおよびＤに対してはプロトコール２が適用された。] 図５
[0044] 心臓を拡張する制御された負荷を培養された心臓弁に対してかけるために、プロトコール１または２にしたがった規定の歪みが組織工学により作製された心臓弁の弁尖において誘導されるように、かけられる負荷の大きさが調整された。脈動ポンプを制御する歪み制御ループをバイオリアクターソフトウェア中に実装することによって、培養された弁では所望の歪みが得られた。この制御ループによって、誘導され、したがって測定された歪みがプロトコール１または２の所定の負荷に似るようにすることによって、かけられた負荷を調整することが可能になる。かけられた負荷は、調整中に調節されなければならない。それは、弁の力学的特性は調整中に変化するからである。調整は、ある負荷において体積の変化に影響を及ぼす。]
[0045] 図６ａと図６ｂは、調整中における体積の変化の測定結果を示す。図６ａの測定値は、調整プロトコール１を用いて得られた。図６ｂの測定値は、調整プロトコール２を用いて得られた。適用されたいずれのプロトコールでも、かけられた負荷は、弁の歪みが規定の歪みに対応するようにするために、連続的であった。表２は、規定の体積の変化と実際に測定された体積の変化との相対誤差を示す。これらの結果が示すのは、調整プロトコールを用いて弁を培養することが可能であるということである。調整プロトコールは、かけられた負荷を個々の弁の力学的特性に適合させる。発達中および発達後の弁の力学的特性を評価できることともに、最適な調整プロトコールに従って弁を培養することが可能である。それは、弁の力学的特性の変化に対して調整を適合させることができるからである。] 図６ａ 図６ｂ
[0046] ]

权利要求:

請求項1
心臓弁などの組織工学により作製された構造物を製造するための方法であって、バイオリアクターチャンバ中に細胞播種足場を供給し、バイオリアクターチャンバを細胞播種足場によって第１の区画と第２の区画とに分けるステップと、細胞播種足場をバイオリアクターチャンバ内部の培養液の流れにさらすことによって、細胞播種足場を組織構造へ、そしてさらに組織構造物へと発達させるステップと、培養液の流れによって、発達中の組織構造に対して動的な圧力差をかけることによって、組織構造上に動的歪みを誘導するステップと、動的な圧力差を測定するステップと、発達中の組織構造の体積の変化を測定するステップと、測定された体積の変化および組織構造がバイオリアクターチャンバ内部にあるときに組織構造上にかけられた圧力差から、組織構造の少なくとも１つの力学的特性の大きさを決定するステップと、決定された少なくとも１つの力学的特性の大きさが所定の閾値を越えているどうかを判定するステップと、決定された少なくとも１つの力学的特性の大きさが所定の閾値を越えていない場合には、組織構造を培養液の流れにさらし続けることによって、動的歪みを誘導するステップと、決定された少なくとも１つの力学的特性の大きさが所定の閾値を越えている場合には、組織構造を培養液の流れにさらし続けることを停止するステップと、を含む方法。
請求項2
測定された体積の変化から局所的な組織の歪みを決定するステップに特徴を有する請求項１に記載の方法。
請求項3
数値モデルを適用することによって、組織構造および／または局所的な組織の歪みの少なくとも１つの力学的特性の大きさを決定するステップに特徴を有する請求項１または２に記載の方法。
請求項4
決定された局所的な組織の歪みによって、および／または決定された組織構造の少なくとも１つの力学的特性の大きさによって、動的な圧力差を変化させるステップに特徴を有する請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
請求項5
動的な圧力を徐々に増大させるステップに特徴を有する請求項５に記載の方法。
請求項6
１０ｋＰａ〜２０ｋＰａ、より好ましくは１３ｋＰａ〜１７ｋＰａの最大値まで、動的圧力を徐々に大きくすることを特徴とする請求項６に記載の方法。
請求項7
０．１Ｈｚ〜１０Ｈｚ、より好ましくは０．５Ｈｚ〜３Ｈｚの周波数を有する動的な圧力差をかけるステップに特徴を有する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
請求項8
少なくとも６日間、より好ましくは１６〜２８日間、動的な圧力差をかけるステップに特徴を有する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
請求項9
細胞播種足場を２ｍｌ／分〜６ｍｌ／分の速度で培養液の連続する流れにさらすことによって、細胞播種足場上の細胞を組織構造へと発達させるステップに特徴を有する請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
請求項10
バイオリアクターチャンバ中の培養液の連続する流れが、動的な圧力差が発達中の組織構造に対してかけられる前に少なくとも３日間、細胞播種足場に対してかけられるステップに特徴を有する請求項１０に記載の方法。
請求項11
組織工学により作製された構造物が心臓弁であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
請求項12
閉じた状態の心臓弁に発達中の組織構造に対して動的な圧力がかけられることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
請求項13
心臓弁などの組織構造物をテストするための方法であって、テストされる組織構造物をバイオリアクターチャンバ中に供給し、バイオリアクターチャンバを組織構造物によって第１の区画と第２の区画とに分けるステップと、組織構造に対して動的な圧力差をかけることによって組織構造上に動的歪みを誘導するステップと、動的な圧力差を測定するステップと、を含み、組織構造物の体積の変化を測定するステップと、測定された体積の変化および組織構造上にかけられた圧力差から、組織構造物の少なくとも１つの力学的特性の大きさを決定するステップと、に特徴を有する方法。
請求項14
動的な圧力差をかけるために、組織構造物をバイオリアクターチャンバ内部の培地の流れにさらすステップに特徴を有する請求項１３に記載の方法。
請求項15
組織構造物がバイオリアクターチャンバの内部に存在する間に、組織構造物の少なくとも１つの力学的特性の大きさを決定するステップに特徴を有する請求項１３または１４に記載の方法。
請求項16
テストされる組織が閉じた状態の心臓弁であることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。